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1、模板DNA；

2、引物；

3、四種脫氧核糖核苷酸；

4、DNA聚合酶；

5、反應(yīng)緩沖液、Mg2+等。

2、退火(annealling)：當(dāng)溫度降低時,引物與模板DNA中互補區(qū)域結(jié)合成雜交分子,低溫下,引物與模板DNA互補區(qū)結(jié)合（55℃,30s）。

3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPS、 Mg2+存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈,中溫延伸,DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(yīng)（70～72℃,30～60s）

一、無Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值,使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度,但不能超過50?mmol/L,否則會抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:終濃度為1.5～2.0mmol/L,其對應(yīng)dNTP為200?μmol/L,注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系,由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g2+,當(dāng)dNTP濃度達到1?mmol/L時會抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。、

三、BSA：一般用乙�；�的BSA,起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用,對Taq酶有保護作用。

四、底物（dNTPs）：dNTPs具有較強酸性,其儲存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5,一般存儲濃度為 10 mmol/L,各成份以等當(dāng)量配制,反應(yīng)終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應(yīng),但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性,而反應(yīng)速度會降低。

五、Taq酶：能耐95℃高溫而不失活,其最適pH值為8.3～8.5,最適溫度為75～80℃,一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板,以堿基互補原則為基礎(chǔ),按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端,合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性,沒有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.5～5個單位/100μl。

六、模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高,但應(yīng)盡量不含有對PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高,否則擴增可能不會成功,在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。

七、引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L,濃度過高會引起錯配和非特異擴增,濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般15～30個堿基,引物過長或過短都會降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對,末位堿基最好選用A、C、G（因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸）。

引物G+C約占45～55%,堿基應(yīng)盡量隨機分布,避免嘧啶或嘌呤堆積,兩引物之間不應(yīng)有互補鏈存在,不能與非目的擴增區(qū)有同源性。

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數(shù)字PCR儀溫度校準(zhǔn)儀

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PCR儀熒光校準(zhǔn)儀

簡介：CYLC 系列一體式高精度 PCR 儀熒光檢測與校準(zhǔn)系統(tǒng),利用物理發(fā)光精確模擬 PCR 儀擴增反應(yīng)過程中的熒光變化。熒光模擬器每個光學(xué)探頭支持獨立的光學(xué)設(shè)定, 支持?jǐn)?shù)萬等級的高精度亮度調(diào), 布點符合國標(biāo)《JJF 1527-2015 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》,可對市面上各大廠商 PCR 儀進行檢測和校準(zhǔn), 滿足市場對 PCR 儀光學(xué)系統(tǒng)檢定和校準(zhǔn)的需求。