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基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是一種將外源基因以在體(in vivo)或離體(in vitro)的方式導(dǎo)入到靶細胞核內(nèi)的技術(shù), 屬于基因工程技術(shù)(亦稱重組DNA 技術(shù))的一個重要組成部分�；�因工程技術(shù)以分子生物學(xué)等學(xué)科發(fā)展為基礎(chǔ), 使人類擁有了構(gòu)造生物遺傳物質(zhì)新組合的能力。

對在體方式而言, 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)需要跨越細胞外和細胞內(nèi)雙層障礙。細胞外的轉(zhuǎn)移過程中遇到的障礙有:DNA 在血漿中的降解、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織對于DNA的吸收、難以將DNA 定位到特定的器官、轉(zhuǎn)染為黏液所阻止等;細胞內(nèi)的障礙包括:溶酶體對DNA 的降解作用、DNA 胞漿的穩(wěn)定性以及DNA 向質(zhì)粒的移位等。

基因槍技術(shù)等直接轉(zhuǎn)移方法是人們以物理方法來將基因轉(zhuǎn)移的方法 。

基因槍法是一種基因?qū)�入儀技術(shù),它把遺傳物質(zhì)或其他物質(zhì)附著于高速微彈直接射入細胞、組織和細胞器,是目前國際上最先進的基因?qū)�入技術(shù)。氣體基因槍以壓縮氣體(氦或氮)轉(zhuǎn)換成的氣體沖擊波為動力,使氣體基因槍槍產(chǎn)生一種"冷"的氣體沖擊波進入轟擊室,因此可免遭由"熱"氣體沖擊波引起的細胞損傷。氣體基因槍可在廣泛的細胞型中得到瞬時的、穩(wěn)定的和高效率的轉(zhuǎn)化作用。氣體基因槍有一個產(chǎn)生沖擊波的特殊結(jié)構(gòu),在恰當(dāng)?shù)臍鈮悍秶鷥?nèi)從3.5MPa-10MPa,具有相應(yīng)不同的可破裂膜,將包覆DNA的粒子穿越,射入在轟擊室底部的靶細胞中(最大靶直徑50mm)。基因槍適用于動植物、細胞培養(yǎng)物、胚胎、細菌及小型動物的轉(zhuǎn)基因。具有快速、簡便、安全、高效的特點。中科院遺傳所、北京大學(xué)、浙江大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、西北農(nóng)林科技大學(xué)等有關(guān)單位均采用該設(shè)備。

基因槍的歷史可以追溯到1987年。

第一代基因槍是臺式基因槍,其中火藥型臺式基因槍是基因槍中最原始的類型。最早的基因槍是由美國康奈爾大學(xué)Sanford于1987年與該校工程技術(shù)專家Wolf及Kallen合作研究出的一種基因轉(zhuǎn)移的新方法。該方法一經(jīng)發(fā)明便在學(xué)界嶄露頭角,Klein等人于1987年最早應(yīng)用基因槍進行洋蔥表皮細胞的轉(zhuǎn)化,并獲得了成功。

基因槍自1987年誕生以來得到迅速發(fā)展。美國康乃爾大學(xué)自1988年先后申報了三個關(guān)于基因槍技術(shù)的專利(EP 0331 855A2,1988:US Patent Number 4,945,050 July 31,1990:US Patent Number 5,036,006 July 30,1991)。1987-1990年間,高壓放電、壓縮氣體驅(qū)動等各種基因槍相繼出現(xiàn),并都在重復(fù)的實踐中得到改進和發(fā)展。McCABe于1988年將目的基因包于鎢粉上,電轟擊大豆莖尖分生組織,結(jié)果約有2%的組織通過器官發(fā)生途徑獲得再生植株,在子代中檢測到了外源基因。1989年氣動式基因槍轉(zhuǎn)化煙草等植物獲得成功,并且得到了瞬時表達。大麥的轉(zhuǎn)基因技術(shù)比起其他植物相對發(fā)展速度較慢,直到1989年,Kartha等人用大麥的細胞和組織進行培養(yǎng),成功檢測到報告基因的瞬時表達。

1990年,美國杜邦公司(DuPont Company)推出首款商品基因槍PDS-1000系統(tǒng)。該儀器是一種"biolistic"臺式基因槍,有關(guān)的工藝技術(shù)是從一個小型的Biolistics公司(負責(zé)人來自康乃爾大學(xué))購買的。據(jù)康乃爾研究基金會副主席和大學(xué)專利及技術(shù)市場的負責(zé)人W.Haeussler說,向杜邦公司轉(zhuǎn)讓的這個技術(shù)是當(dāng)時康乃爾發(fā)明的一次最大交易,將總數(shù)228萬美元的專利稅和研究支持費一次性付給康乃爾大學(xué)。當(dāng)時由伯樂公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.)與杜邦簽署的的代工與分銷商協(xié)議。隨后,伯樂公司1992年推出了PDS-1000/He槍。國內(nèi)中國科學(xué)院生物物理所和清華大學(xué)也分別于1989年和1991年推出了新的槍種并申請了專利(中國專利89109334和91207467)。與現(xiàn)在新型手持型基因槍不同,臺式基因槍體積偏大,實驗場所受限,不能靈活應(yīng)用于田間地頭。高壓氣體需要抽真空,壓縮機工作時噪音較大,而且過高氣壓推動微粒子轟擊使得臺式基因槍僅限于細胞轉(zhuǎn)殖而不能用于活體轉(zhuǎn)殖。第一代基因槍的每槍轟擊成本也很高,金粉與控制氣壓用的Rapture disk均造價不菲。

第二代基因槍出現(xiàn)于1996年,伯樂公司推出了Helios手持式基因槍。這是歷史上最早出現(xiàn)的手持式基因槍。該系統(tǒng)通過可調(diào)節(jié)的氦氣脈沖,來帶動位于小塑料管內(nèi)壁處預(yù)包有DNA、RNA 或其它生物材料的金粉顆粒,將其直接打入細胞內(nèi)部。與第一代臺式基因槍相比,Helios手持式基因槍摒棄了抽真空壓縮機,犧牲了一些氣體壓力,從而使活體動物轉(zhuǎn)殖成為可能,可以對活體動物的肌肉、皮膚直接進行轉(zhuǎn)殖。因其體積小巧,方便實驗人員隨身攜帶,大大地拓寬了基因槍的應(yīng)用范圍。在隨后的10年里,Helios手持式基因槍被廣泛應(yīng)用于由原生質(zhì)體再生植株較為困難和農(nóng)桿菌感染不敏感的單子葉植物的基因轉(zhuǎn)殖。在基因槍以前,外源DNA進入細胞質(zhì)后很難穿過雙層膜的細胞器。用基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化這類細胞器,轉(zhuǎn)化頻率高,重復(fù)性好,是目前該領(lǐng)域研究中最常用和最有效的DNA導(dǎo)入技術(shù)。相比較第一代臺式基因槍而言,手持式基因槍由于氣體壓力較小(僅有100-600 PSi),而不能穿透成熟葉片的細胞壁,一定程度上影響了其在植物中轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用范圍,不過與臺式基因槍互補,Helios很好地延伸了基因槍的應(yīng)用領(lǐng)域。

同樣是利用高壓氣體傳送基因,制作技術(shù)的改良使得基因槍從細胞轉(zhuǎn)殖到活體轉(zhuǎn)殖,從臺式到手持,一步一步將基因槍的應(yīng)用范圍擴大。首先意識到并積極嘗試?yán)�用基因槍的生命科學(xué)工作者在轉(zhuǎn)基因工作中的科研水平得到了極大提高,轉(zhuǎn)基因工作者的想象力也因此得到了解放。蒸蒸日上的基因槍技術(shù)被學(xué)界寄予厚望,視為轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的明日之星。不過慢慢地人們發(fā)現(xiàn),活體動物的臟器相比于皮膚、肌肉要脆弱得多,如小鼠活體的肝和脾最多只能承受40psi的壓力,在100psi的高壓氣體沖擊下器官會被嚴(yán)重破壞而導(dǎo)致實驗失敗。而過低的氣體壓力并不能令基因微載體具有足夠的動量打入細胞內(nèi)部。氣體壓力與粒子傳遞速度的矛盾成了基因槍發(fā)展的瓶頸,這個問題在之后的10年一直困擾著各大生命科學(xué)儀器廠商的研發(fā)團隊。

直到2009年,Wealtec公司推出GDS-80低壓基因傳遞系統(tǒng)(又稱:GDS-80基因槍)(US Patent Number 6,436,709 B1),引領(lǐng)了第三代基因槍技術(shù)發(fā)展方向。GDS-80手持式基因槍巧妙地從流體動力學(xué)與航空動力學(xué)入手,使用氦氣或氮氣于低壓狀態(tài)加速生物分子至極高的速度,完成基因傳送,從一個全新的角度解決了氣壓與粒子速度的矛盾。第三代基因槍的超低壓(10-80 psi)推動,不僅沒有犧牲反而大大增加了微粒子的傳輸動量,因此不僅使基因槍能夠成功應(yīng)用于僅在低壓狀態(tài)下才能完成的動物活體器官層面轉(zhuǎn)殖;而且相比較于第二代手持式基因槍,GDS-80射出的攜基因微粒子因為其本身的高動量,居然能夠像臺式基因槍發(fā)射出的粒子一樣穿透植物細胞壁穿入植物細胞完成轉(zhuǎn)殖,而在此之前,完成這一工作的第一代臺式基因槍需要至少1000-2000psi的高壓氣體。在動物細胞,尤其是活體動物轉(zhuǎn)殖實驗中,本身具備高動量的生物粒子毋需借由微粒子載體(如金粒子)的攜附方式轉(zhuǎn)移至目標(biāo)體中,這在避免了靶細胞內(nèi)異物殘留問題的同時,大大降低了實驗成本。第三代基因槍的低壓傳導(dǎo),使得細胞損害與槍體轟擊的噪音都大大減少,并有效地在動物實驗中降低了由金粉微載體帶來的昂貴開銷。GDS-80基因槍"子彈"的制備也從干式轉(zhuǎn)為濕式,節(jié)省了烘干的時間,簡化了流程。

1、基因轉(zhuǎn)殖于目標(biāo)細胞,組織,器官或活體

2、基因功能短暫表現(xiàn)之研究

3、功能穩(wěn)定性表現(xiàn)之研究

4、遺傳或癌癥相關(guān)之研究

5、DNA疫苗的研究與應(yīng)用

6、基因治療相關(guān)之研究

7、基因轉(zhuǎn)殖植物之研究

8、基因工程或藥物相關(guān)研究

基因槍在棉花轉(zhuǎn)基因中的優(yōu)勢

在迄今發(fā)展起來的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)中,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最為廣泛。自1987年Umbeck等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得坷字棉轉(zhuǎn)基因植株后,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法逐漸成為國際上最普遍的轉(zhuǎn)化手段,并且取得很大進展。中國農(nóng)科院棉花研究所成功建立了20多個棉花品種的高效、穩(wěn)定的規(guī)�；�轉(zhuǎn)化體系,實現(xiàn)了流水線操作,建立了高效、工廠化的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是理論和實踐都較為完善的一種轉(zhuǎn)化技術(shù),且已被廣泛用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化,但該方法受宿主基因型范圍的限制,很多優(yōu)良品種(系)很難以此法進行轉(zhuǎn)化,并且轉(zhuǎn)化程序煩瑣復(fù)雜�；ǚ酃芡ǖ擂D(zhuǎn)化法雖然沒有基因型、種屬控制,但其轉(zhuǎn)化技術(shù)不太完善,對轉(zhuǎn)化機制缺乏系統(tǒng)的研究,常局限于開花期才能應(yīng)用。因此,需要發(fā)展出有效的基因轉(zhuǎn)化方法。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所葉武威等人在2013年開發(fā)出一種棉花的基因槍活體快速轉(zhuǎn)化方法,通過第三代便攜式基因槍和優(yōu)化轉(zhuǎn)化的參數(shù)使活體轉(zhuǎn)化時對花蕾和花粉形成微創(chuàng)傷,大大縮短了獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期。該方法包括如下步驟:(1)利用基因槍轟擊的方法,將含有外源基因的載體轟入父本棉花的花粉中;(2)將基因槍轟擊后的父本花粉授粉到活體母本棉花中;(3)授粉后的母本棉花所結(jié)的種子便是轉(zhuǎn)基因棉花種子,實現(xiàn)了棉花的基因轉(zhuǎn)化。此方法無需組織培養(yǎng)步驟,直接在活體棉花上便實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化,實用、易操作、不依賴組織培養(yǎng)、穩(wěn)定性好。